早在之前两篇系列推文中我们分别阐述了超螺旋质粒和mRNA原液的有关工艺及应用，而对于mRNA的成药性而言，不可或缺的重要环节是其递送技术，通过递送技术的结合对mRNA进行装载来实现保护及精准递送。目前，相对比较成熟的mRNA递送技术主要溯源于Arbutus的LNP配方专利，其配方主要包含四种功能性脂质：可离子化脂质、胆固醇、中性脂质、PEG脂质，其结构及主流配方比例见图1。近年来，由于新冠疫情的爆发，大家争相进入赛道，对于LNP的技术开发及其膜过滤应用的需求也迅速扩增，本文将结合科百特的产品应用对其关键工艺控制进行阐述及案例展示。

LNP--合成

首先，对于LNP的制备通常利用微流控技术将醇相的脂质和水相的mRNA经过其混合流道快速混合（如图2），其配方组成、比例、混合流道的流体模型都是LNP包封率、颗粒大小及均一性的关键影响因素，在脂材与mRNA混合接触时会通过静电及分子间作用力进行自组装而形成LNP纳米粒，而在形成纳米粒后的乙醇浓度含量和辅料缓冲体系都会影响LNP的粒径及分布变化，对其稳定性的影响也是至关重要的[2]。

LNP--浓缩&除醇&换液--TFF

对于LNP体系中乙醇的去除通常需要以切向流过滤（Tangential-Flow Filtration,TFF）的方式，通过浓缩换液来实现（如图3）。而对于该环节滤器的应用考量，我们需要关注膜类型、材质、精度以及过滤工艺参数对其LNP自身特性指标的影响。科百特可供选择的膜类型有如图4所示的中空纤维和平板膜包，就中空纤维而言，其开放式流道对物料所产生的剪切力更低，对于LNP这种剪切力敏感物料来说是非常友好的。而平板膜包的优势在于其具有较高的通量水平，整体效率更高，在控制合适工艺参数的情况下对LNP物料的影响也可降至最低。

综合目前上市及临床产品和科百特应用数据来看，其mRNA-LNP的切向流过滤应用，尚以RC再生纤维素材质，300kda膜包最为优异，mPES材质300kda中空纤维略逊于此。而我们在LNP切向流工艺开发过程中，往往会过多的关注其过滤时间和LNP滤后参数的变化，而忽略其初始物料LNP的体系状态、特性参数指标是影响LNP的TFF过程及效果的最关键因素，其中较为显著的影响因素如LNP纳米粒的多分散系数PDI，应尽可能控制在0.1左右的较低水平，只有当我们LNP工艺相对稳定且颗粒度分散较均一的情况下，再进行后续TFF工艺的探索才最具更大的参考价值和意义。

LNP--浓缩&除醇--SPTFF

除上述传统超滤外，LNP超滤还有一款重磅创新产品的应用，即单向切向流过滤SPTFF，传统TFF与SPTFF运行模式区别如图5所示，通过SPTFF对LNP进行高倍浓缩的同时达到降低乙醇含量至目标浓度的效果，基于其低剪切低循环次数的特性优势，实现连续流生产的同时降低了对mR-NA-LNP自身质量属性的影响。目前已在客户端应用实现了非常高效的高倍浓缩及除醇效果(如图6），并很高程度上保持了原LNP的特性参数且具有较高的样品回收率。

LNP--终端除菌

LNP的除菌过滤选型也不寻常于常规物料，其制剂中LNP纳米粒虽分散于水相buffer中，但其自身结构为脂类双分子层结构，以利于其在体循环过程中与细胞膜融合并实现核酸药物的胞内递送。因此，对于其除菌膜材的选型科百特也基于同一物料进行了多款除菌滤器系列的评估对比，如下案例，见图7：SMD系列（改性亲水PVDF膜）除菌滤器相比SAF系列（PES膜、高通量改性）及SLE系列（PES膜、低蛋白吸附改性）在两倍通量情况下仍具有较高的载量优势，且滤前滤后LNP自身的特性指标如粒径、PDI、包封率及mRNA含量均基本保持不变，其对LNP物料的除菌应用具有较高的性能及适用性。

综上，针对LNP工艺阶段的膜过滤应用，科百特有膜包、中空纤维、SPTFF、除菌滤器及定制化一次性除菌过滤系统等多种优异解决方案可供大家选择，欢迎有需求的用户前来咨询，获得样品测试及技术支持。